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宏基因組測序mNGS在新型冠狀病毒檢測中的應用

發布日期:2022-11-03 瀏覽次數:1725

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此次新型肺炎疫情監測和防控中,病原宏基因組測序(mNGS)發揮了至關重要的作用,利用其技術優勢,研究人員在5天內就鑒定分析出新型冠狀病毒的基因組,而2003年SARS的鑒定耗時5月余、2013年H7N9的鑒定耗時1月余。


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2020年2月5日,武漢大學病毒學國家重點實驗室、武漢大學中南醫院、華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院和中山大學醫學院的聯合研究結果,發表在《Emerging Microbes & Infections》(IF = 6.212)雜志上,題目為《RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak》。文章中通過mNGS技術在2例肺炎病例中檢測出2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)。事情始于2019年12月底,臨床上發現2例肺部病毒感染病例,但常規抗病毒和抗感染效果不佳,后病情加重。于是采集了患者呼吸道和血液樣本進行常規呼吸道病原體臨床實驗室檢測,包括流感病毒、呼吸道合胞體病毒、腺病毒、偏肺病毒、支原體肺炎、衣原體肺炎、軍團菌等,均為陰性。其余RNA樣本進行SARS-CoV特異性RT-PCR檢測,有一組實驗結果為陽性。對相應的PCR產物進一步測序發現患者病原體的病毒可能是冠狀病毒,但不是SARS-CoV。于是,從肺泡灌洗液(BALF)樣本中提取的總RNA進行宏基因組新一代測序(mNGS)文庫構建和測序。采用Illumina Miseq平臺對文庫進行150 bp雙端測序。對測序結果分析發現,檢測到的病毒reads中大部分與冠狀病毒相關(樣本1和樣本2分別為99.9%和99.7%),另外在樣本2中檢測到嗜二氧化碳噬細胞菌和韋榮氏球菌,但這兩種細菌的致病性尚未清楚。利用Megahit對reads進行從頭組裝,形成一個30 kb的與CoV具有序列同源的contigs。經過序列匹配確認,最終的CoV基因組為29881 nt。通過序列同源性分析,表明該病毒與此前已知的可以感染人類的冠狀病毒存在較大差異,且通過對病毒的基因序列進行進化溯源分析,成功鎖定蝙蝠為病毒的自然宿主,但直接宿主還有待進一步確定。后又進行了基因組比對和進化分析,mNGS結果顯示,除少量SNP外,患者1和2共識基因組序列相同,表明兩個患者在不同時間感染了同一冠狀病毒。此項研究中,mNGS在疫情爆發的早期協助研究人員確定了感染原因為一種新型冠狀病毒。

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2020年2月11號,中國醫學科學院北京協和醫學院病原生物學研究所、中日友好醫院國家呼吸系統疾病臨床研究中心呼吸內科、北京協和醫學院中國醫學科學院呼吸醫學研究所、武漢市疾病預防控制中心、武漢市金銀潭醫院等單位聯合的研究成果發表在《Chinese Medical Journal》雜志上,題目為《Identification of a novel coronavirus causing severe pneumonia in human a descriptive study》。此研究中,研究者收集了湖北省武漢市金銀潭醫院5例重癥肺炎患者的臨床資料和支氣管肺泡灌洗液樣本,提取樣本中的RNA后也進行了mNGS檢測分析。結果顯示5例標本中均發現了一個前所未知、與SARS 病毒核苷酸序列相似度79%、與蝙蝠來源毒株最接近、但形成單獨進化分支的新的冠狀病毒β屬毒株序列?;诨蛐蛄行畔?,研究者們繼續開展病毒分離,并進行形態確認和血清學檢測,最終確認了該冠狀病毒為新型冠狀病毒(2019-nCoV)。

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2020年2月13日,國家兒童醫學中心(上海)-上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心精準醫療實驗診斷中心的研究人員在《中華檢驗醫學雜志》上發表《病原宏基因組測序在新型冠狀病毒檢測中的應用與挑戰》。文章中回顧了mNGS在各類感染病原診斷中的臨床應用進展,并探討其在應用中面臨的問題和挑戰。文章指出:mNGS是一種基于二代測序技術的無需培養、無偏好性的病原檢測技術,可一次性完成細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種病原體檢測。因此,mNGS為本次疫情感染病原體的進一步確認以及防控爭取了時間,也為后續的臨床診斷、治療和藥物研發指明了方向。此外,mNGS還可以同時對新型冠狀病毒以外的其他病原及混合感染進行綜合鑒定。但另一方面,由于mNGS操作復雜、成本較高、檢測時間相對較長等原因,在新型冠狀病毒的檢測上無法實現大范圍推廣和快速診斷。因此,mNGS可與實時熒光定量PCR(RT-PCR) 技術聯合使用,實現優勢互補。

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nCoV的起源和進化史(圖片來源于文獻)

mNGS在此次2019-nCoV疫情監測和防控中發揮了重要作用。除此之外,mNGS在病原微生物檢測和鑒定中的應用先前也有報道,例如:2014年新英格蘭醫學雜志發表 mNGS 確診鉤體病的首例臨床應用案例;2018年來自復旦大學附屬華山醫院的Ai等人報道了感染豬的病原體豬皰疹病毒可跨物種傳播,導致人發生眼內炎感染的案例。近年來,mNGS在潛在病原體診斷方面應用的案例逐漸增多,其優勢和應用價值也日益凸顯。因此,在信息時代,mNGS的臨床應用也是病毒診斷的未來趨勢。


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